Validación analítica de una plataforma de PCR en tiempo real basada en la amplificación del Gen LipL32 para la detección de especies patógenas de Leptospira en muestras de sangre [recurso electrónico] / José Guadalupe Guerrero Velázquez ; director, Francisco Javier Monge Navarro ; codirector, Gilberto López Valencia.

Maestría en Ciencias Veterinarias.

Tesis (Maestría) - Universidad Autónoma de Baja California Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias, Mexicali, 2017.

Incluye referencias bibliográficas.

La leptospirosis es una zoonosis bacteriana de distribución mundial causada por especies patógenas del género Leptospira. La leptospirosis afecta a especies animales dedicadas a la producción de alimentos y animales de compañía. El diagnóstico de leptospirosis se basa en la prueba de microaglutinación (MAT) que se considera como prueba de referencia, sin embargo; está disponible solo en laboratorios de referencia con personal calificado y estrictas normas de bioseguridad. Aunque MAT sigue siendo la prueba de referencia a nivel mundial, requiere de 7 a 10 días para su realización, no detecta anticuerpos en los primeros días de la infección y tampoco puede distinguir entre un caso de infección natural, la respuesta de anticuerpos por administración de vacunas o si la respuesta es debido a una infección previa.
El diagnóstico de la leptospirosis empleando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) basado en la amplificación del gen que codifica para la proteína de fusión LipL32, ha sido probado y documentado en numerosos artículos científicos desde principio de la década pasada. A pesar de las ventajas técnicas que resultan del desarrollo de plataformas de diagnóstico molecular para leptospirosis, en la actualidad no se cuenta con reportes de validación analítica para ninguno de los procedimientos disponibles en las bases de datos públicas, lo que significa que esas plataformas no han sido sometidas a procesos estandarizados para evaluar y medir sus parámetros de precisión, exactitud, sensibilidad analítica y rango de informe, de tal forma que las pruebas garanticen altos niveles de repetibilidad y reproducibilidad en los resultados, independientemente del laboratorio que las ejecute.
En este trabajo se logró exitosamente la validación analítica de una plataforma RT-PCR que detecta y amplifica un fragmento de ADN del gen que codifica para la proteína de fusión conocida como LipL32. La validación analítica de la plataforma RT-PCR de LipL32 surge como respuesta a la necesidad de una herramienta de diagnóstico confiable, precisa y rápida para detectar leptospirosis, una enfermedad que se caracteriza por desarrollar una serie de signos y síntomas que por sí solos no proporcionan evidencia suficiente para declarar la enfermedad, donde la serología es complicada de realizar y produce resultados inconclusos o el cultivo microbiológico, que toma demasiado tiempo para producir un resultado positivo, ocasionando en cualquiera de esos casos, retrasos en la iniciación de la terapia con antibióticos y repercutiendo en el tiempo requerido para recuperar el estado de salud. De los resultados del proceso de validación, el parámetro precisión entre y dentro de las corridas para cada categoría del ciclo de amplificación demostraron alta repetibilidad y reproducibilidad al obtenerse una media de 18.58 ciclos con una desviación estándar total de 1.35 y un coeficiente de variación total de 7.3%, lo cual indica que entre y dentro de las 20 corridas se presentó una imprecisión menor a 2 ciclos. Para la variable temperatura de fusión (Tm) se obtuvo un promedio de 81.84 ºC precisión entre y dentro de las corridas con una desviación estándar total 0.31 y un coeficiente variación total 0.4%.
Los resultados para (Tm) entre y dentro laboratorios produjeron un promedio de 81.85 ºC con una desviación estándar de 0.304 y un coeficiente de variación total de 0.40, demostrando muy baja variabilidad entre y dentro corridas tanto en un solo laboratorio como entre y dentro de los dos laboratorios utilizados. Los resultados del parámetro exactitud presentaron un sesgo de -0.06 para las 440 observaciones con un promedio de 81.84 ºC con un valor óptimo de referencia calculado en 82.0°C de acuerdo a la temperatura de disociación de producto amplificado del gen Lipl32, lo cual demuestra estadísticamente que el 100% de las réplicas (IC 95%) estuvieron dentro del rango 81.0°C a 83.0°C de la temperatura de fusión calculada y permitieron establecer el punto de corte entre muestras positivas y negativas. Asimismo, el parámetro de rango de informe se cumple al resultar el 100% de las muestras positivas con resultado positivo y el 100% de los controles negativos de referencia con resultado negativo. El límite detección de la plataforma RT-PCR para LipL32 fue establecido en 10 equivalentes genómicos por reacción de 10 μl en la dilución 10-6 del ciclo 38.8. Se concluye que la plataforma RT-PCR de LipL32 fue exitosamente validada al probar un número suficiente de muestras en un número de repeticiones que duplica el mínimo requerido por organizaciones internacionales dedicadas al control de calidad y que los parámetros de precisión, exactitud, sensibilidad analítica y rango de informe que resultan en una plataforma robusta y confiable para ser aplicada en el diagnóstico molecular de leptospirosis en muestras de sangre de perros.